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Kanalaktivitäten bei Pflanzen-CNLs konserviert sind, ist unbekannt.Hier berichten wir über die kryoelektronenmikroskopische Struktur des Weizen-CNL Sr355 im Komplex mit dem Effektor AvrSr356 des Erregers des Weizenstammrosts.Die direkte Effektorbindung an die leucinreichen Wiederholungen von Sr35 führt zur Bildung eines pentameren Sr35-AvrSr35-Komplexes, den wir als Sr35-Resistosom bezeichnen.Weizen-Sr35- und Arabidopsis-ZAR1-Resistosomen weisen bemerkenswerte strukturelle Ähnlichkeiten auf, einschließlich eines Arginin-Clusters in der Leucin-reichen Repeats-Domäne, das zuvor nicht als konserviert erkannt wurde, das gleichzeitig auftritt und intramolekulare Wechselwirkungen mit dem „EDVID“-Motiv in der Coiled-Coil-Domäne bildet.Elektrophysiologische Messungen zeigen, dass das Sr35-Resistosom eine nicht-selektive Kationenkanalaktivität aufweist.Diese strukturellen Einblicke ermöglichten uns die Generierung neuer Varianten eng verwandter NLRs aus Weizen und Gerste, die AvrSr35 erkennen.Unsere Daten unterstützen die evolutionäre Konservierung von CNL-Resistosomen in Pflanzen und zeigen den Grundsatznachweis für die strukturbasierte Entwicklung von NLRs zur Verbesserung von Nutzpflanzen.Pflanzliche nukleotidbindende leucinreiche Wiederholungsrezeptoren (NLRs) sind intrazelluläre Rezeptoren, die eine Schlüsselrolle im angeborenen Immunsystem der Pflanze spielen, indem sie das Vorhandensein von Pathogeneffektoren erkennen, die während der Pathogenese durch direkte oder indirekte Erkennung in Pflanzenzellen abgegeben werden1,7.Die Aktivierung pflanzlicher NLRs führt im Allgemeinen zu einer Reihe von Immunantworten, die oft mit einem schnellen Zelltod des Wirts an Orten einer versuchten Pathogeninfektion verbunden sind.Strukturelle und funktionelle Homologe pflanzlicher NLRs entwickelten sich aus unabhängigen Ereignissen für intrazelluläre Nicht-Selbstwahrnehmung bei der angeborenen Immunität von Tieren und sind durch ihre konservierten zentralen Nukleotidbindungs- und Oligomerisierungsdomänen (NODs)8 gekennzeichnet.Pflanzen-NLRs können grob in zwei Klassen eingeteilt werden: CNL mit einer N-terminalen Coiled-Coil-Domäne und TNL mit einer N-terminalen Toll/Interleukin-1-Rezeptor(TIR)-Domäne.Unter den Blütenpflanzen besitzen zweikeimblättrige Pflanzen typischerweise beide Rezeptorklassen, während einkeimblättrige Pflanzen, einschließlich Getreide, nur CNL-Rezeptoren codieren9.Weizenrost durch Pilzbefall mit Puccinia graminis f.sp.tritici (Pgt) bedroht die weltweite Weizenproduktion10, und das Auftauchen weit virulenter Pgt-Stämme, einschließlich der Ug99-Linie, hat die Suche nach Stammrostresistenz im Weizenkeimplasma und in wilden Verwandten in den letzten zwei Jahrzehnten motiviert.Dies führte zur Isolierung von 11 phylogenetisch verwandten Stammrostresistenzgenen (Sr), die zu einer Clade von Gras-CNLs gehören, die alle stammspezifische Immunität verleihen5,11,12,13,14,15,16,17,18 ( 'Klade I'-CNLs, definiert in Lit. 18).Die Mehltau-Resistenz-Locus A (MLA)-Rezeptoren der Weizenschwesterart Gerste gehören ebenfalls zu dieser Gruppe von Gras-CNLs und teilen eine stammspezifische Immunität mit Sr-Genen18.Sr35 wurde zuerst in einer Landrasse des mit Triticum urartu verwandten Triticum monococcum (Einkorn) identifiziert und verleiht Brotweizen Immunität gegen Pgt Ug99, wenn es als Transgen übertragen wird5.Da Sr35 jedoch im diploiden A-Genom des wilden Vorfahren des Weizens, T. urartu, fehlte, fehlte es zunächst im hexaploiden Brotweizen (Triticum aestivum).Die Sr35-Resistenz wurde mit der Erkennung des Pgt-Effektors AvrSr356 in Verbindung gebracht, aber bis jetzt blieb es unklar, ob der durch den Sr35-Rezeptor vermittelte Zelltod des Wirts durch eine direkte physikalische Wechselwirkung mit dem AvrSr35-Effektor ausgelöst wird6,19.Um Sr35 zu reinigen, exprimierten wir das Protein allein oder zusammen mit AvrSr35 in Sf21-Insektenzellen.Unerwarteterweise wurde Zelltod beobachtet, wenn der Rezeptor zusammen mit AvrSr35 exprimiert wurde (erweiterte Daten, Abb. 1a), was darauf hindeutet, dass Sr35 und sein Effektor ausreichen, um diese immunitätsassoziierte Reaktion in Insektenzellen in Abwesenheit anderer Pflanzenproteine ​​zu vermitteln.Um die Zelltodaktivierung für die Proteinreinigung zu umgehen, haben wir Substitutionen in die N-terminalen Reste L15E/L19E (Sr35L15E/L19E) eingeführt, von denen vorhergesagt wird, dass sie für die Assoziation der Sr35-Membran in Analogie zum ZAR1-Resistosom3 wesentlich sind.Es wurde gezeigt, dass eine Mutationsanalyse der entsprechenden N-terminalen Reste des Tomaten-CNL NRC4 die Zelltodaktivität in Nicotiana benthamiana aufhebt20.Tatsächlich reduzierten die Sr35L15E/L19E-Substitutionen den durch Sr35 induzierten Zelltod in Insektenzellen deutlich (Erweiterte Daten Fig. 1a und Ergänzungstabelle 1).Unter Verwendung von affinitätsmarkiertem Sr35L15E/L19E, das mit affinitätsmarkiertem AvrSr35 koexprimiert wurde, konnten wir den Sr35-AvrSr35-Komplex für die anschließende Trennung potenzieller Rezeptorkomplex-Isoformen und korrekt gefalteter Rezeptorkomplexe durch Größenausschlusschromatographie anreichern (Erweiterte Daten, Abb. 1b ,c).Der affinitätsgereinigte Proteinkomplex wurde mit einem breiten Peak mit einer maximalen UV-Absorption bei 65 ml Elutionsvolumen eluiert, die 669 kDa (66 ml) unseres größten Proteinmarkers überstieg.Einzelne Fraktionen wurden durch Negativfärbung analysiert und eine große Anzahl sternförmiger Partikel mit fünffacher Symmetrie identifiziert (Fraktionen bei 60–69 ml; Abb. 1a).Die am stärksten monodispersen Fraktionen wurden gepoolt und für die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)-Analyse verwendet.a, Negative Färbung von gereinigtem Sr35 im Komplex mit AvrSr35 (Sr35-Resistosom).Sternförmige Partikel wurden durch Affinitätsreinigung und Größenausschlusschromatographie angereichert.Monodisperse Sr35-Resistosomen haben eine durchschnittliche Größe von etwa 24 nm.Maßstabsleiste, 100 nm.b, 2D-Klassifikationen der Sr35-Resistosom-Partikel aus der Kryo-EM-Probe.Partikel zeigen bevorzugte Orientierungen für Unter- und Draufsichten.In der Seitenansicht sind weniger, aber ausreichend Partikel vorhanden.Maßstabsleiste, 20 nm.c, Kryo-EM-Dichtekarte mit 3 Å Auflösung (oben) und das endgültig verfeinerte Strukturmodell (unten) des Sr35-Resistosoms, gezeigt in drei verschiedenen Orientierungen.AvrSr35 ist grün gefärbt und Sr35-Domänen werden gemäß den Farbcodes in der eingefügten Tafel angezeigt.Wir analysierten die Sr35-AvrSr35-Komplexprobe durch Kryo-EM (Erweiterte Daten Abb. 1) unter Verwendung von insgesamt 1.608.441 Einzelpartikeln für eine referenzfreie zweidimensionale (2D) Klassifizierung (Abb. 1b).Nach der dreidimensionalen (3D) Klassifizierung wurde eine Teilmenge von 230.485 Partikeln zur Rekonstruktion verwendet, was eine Dichtekarte von 3,0 Å ergab (Abb. 1c, oben).Trotz der hohen Auflösung von bis zu 2,5 Å im Zentrum des Komplexes nahm die Ortsauflösung zum äußeren Rand hin auf etwa 4 Å ab (Erweiterte Daten Abb. 1f), was darauf hindeutet, dass der äußere Bereich des Komplexes flexibler ist.Um diese verringerte Auflösung zu kompensieren, wurde eine lokale Maske für den äußeren Bereich verwendet, was eine lokale Dichtekarte mit einer Auflösung von 3,33 Å ergab (erweiterte Daten, Fig. 1f).Beide Dichtekarten wurden für die Modellbildung verwendet (Abb. 1c, unten).Die endgültige 3D-Rekonstruktion des Sr35-AvrSr35-Komplexes enthält fünf Rezeptorprotomere, die jeweils an ein Effektormolekül gebunden sind.Die Rekonstruktion ergab eine sternförmige Struktur, ähnlich dem ZAR1-Resistosom3, das wir als Sr35-Resistosom bezeichneten.Wie im ZAR1-Resistosom definieren fünf Sr35-NOD-Module die Basis der kreisförmigen Protomeranordnung, und in der Mitte befindet sich ein spiralförmiger Zylinder, der aus den fünf Coiled-Coil-Domänen besteht.Im Gegensatz zu ZAR1 packen die Leucin-reichen Wiederholungsdomänen (LRR) in der äußeren Region im Sr35-Resistosom nicht aneinander, was erklären könnte, warum diese Region flexibler ist.AvrSr35 nimmt eine ausschließlich spiralförmige Faltung an (erweiterte Daten, Abb. 2).Eine 3D-Strukturhomologiesuche unter Verwendung des Servers DALI21 zeigte, dass es keine anderen bekannten Proteinstrukturen gibt, die die AvrSr35-Faltung teilen.Fünf AvrSr35-Proteine ​​binden ausschließlich an den C-terminalen Teil der LRR-Domänen im Komplex.Das zentrale NOD-Modul pflanzlicher NLRs ist in eine Nukleotidbindungsdomäne (NBD), helikale Domäne 1 (HD1) und geflügelte helikale Domäne (WHD) unterteilt.ATP/dATP hat sich als wichtig für die Oligomerisierung von ZAR1 erwiesen, da es die aktive Konformation von ZAR1 über seine Wechselwirkung mit dem WHD im NOD-Modul stabilisiert.Es gibt eine eindeutige Kryo-EM-Dichte an der vorhergesagten Nukleotidbindungsstelle zwischen den HD1- und NBD-Domänen, die nicht durch Sr35 und AvrSr35 gefüllt ist.Ein ATP-Molekül passt gut in diese Kryo-EM-Dichte.Das modellierte ATP ist in einer von HD1 und NBD gebildeten Rille verschachtelt.Die kurze α-Helix, die die Interprotomer-Wechselwirkung vermittelt (Abb. 2a, c), bedeckt auch das ATP-Molekül.Im Gegensatz zu ZAR1 kontaktiert das ATP in Sr35 nicht direkt das WHD.Stattdessen bildet die γ-Phosphatgruppe des ATP eine zweizähnige Wasserstoffbrücke mit Sr35 NBDR157 und NBDR311 (Abb. 2c).Letzteres bildet auch eine Wasserstoffbrücke mit Sr35 WHDS420 (Abb. 2c), was eine indirekte Kopplung der ATP-γ-Phosphatgruppe mit der WHD von Sr35 zeigt.a, Sr35-Resistosom mit lateralem Dimer.Kästchen in Grün, Gelb und Rosa zeigen Positionen der gezoomten Ansichten in c–f.Sr35-Domänen und AvrSr35, gefärbt gemäß der Einsatztafel.b, Struktur eines Sr35-Protomers im Komplex mit AvrSr35.Farbcodes wie in a.Das blaue Kästchen zeigt die Position des strukturellen Details in f.c, Strukturdetails der ATP-Bindung in einem Protomer.Beachten Sie die spezifische Wasserstoffbindung von R311 mit der γ-Phosphatgruppe von ATP in einem Abstand von 2,8 Å.Graue und weiße Rückstandsetiketten entsprechen NBD- bzw. WHD-Rückständen.d, Strukturdetail der Grenzfläche zwischen NBDs eines lateralen Dimers.Gestrichelte Linien repräsentieren polare Wechselwirkungen.Graue und weiße Restmarkierungen entsprechen zwei benachbarten Protomeren aus dem Pentamer.e, Strukturdetail der Grenzfläche zwischen zwei Coiled-Coil (CC)-Protomeren.f, Strukturdetails der intramolekularen Packung von Coiled-Coil und LRR-Domäne in einem Sr35-Protomer.Saure Reste im CCEDIVD bilden Salzbrücken mit basischen Arg(R)-Resten des LRRR-Clusters.g, Cotransfektion von Sr35 und Sr35-Mutanten mit AvrSr35 in Weizenprotoplasten.Relative Lumineszenz als Anzeige für Zelltod.Die EV-Behandlung definierte den relativen Ausgangswert (Mittelwert ± Standardabweichung; n = 5).Teststatistiken abgeleitet aus Varianzanalyse (ANOVA) und Tukey-Post-hoc-Tests (P < 0,05).Genaue P-Werte für alle Protoplasten-Plots sind in der Ergänzungstabelle 3 angegeben. Balkenfarben als Kästchenfarben in c und d.h, Tabakzelltoddaten von Sr35 und Sr35-Mutanten mit AvrSr35.i, Weizenprotoplastendaten von EDIVD- und R-Cluster-Mutanten.Experiment und Statistik wie in g.Balkenfarben als Kastenfarbe in f.j, Zelltoddaten von Nicotiana benthamiana von EDVID- und R-Cluster-Mutanten.Repräsentative Daten in h und j, die von sieben Wiederholungen gezeigt und auf Blattzelltod bewertet wurden.Ähnlich wie beim ZAR1-Resistosom tragen NBD-NBD-Kontakte zur Packung des Sr35-Protomers bei (Abb. 2a, d).Sr35 NBDY244 von einem Protomer liegt eng an Sr35 NBDR259 und Sr35 NBDY263 von einem benachbarten Protomer (Abb. 2d).Zusätzlich wird eine Wasserstoffbrücke zwischen Sr35 NBDY244 und Sr35 NBDR259 aufgebaut.Bemerkenswerterweise trägt die Coiled-Coil-Domäne von Sr35 erheblich zu den Interprotomer-Wechselwirkungen bei (Abb. 2a): Die C-terminale Hälfte der α4-Helix von einem Protomer packt gegen die C-terminalen Seiten der α2- und α4-Helices der benachbarten Coiled-Coil-Protomer.Im Zentrum dieser Grenzfläche im Coiled-Coil befindet sich Tyr141 (CCY141), das ausgedehnte hydrophobe Kontakte mit Sr35, CCL42, CCM43, CCL47 und CCW65 herstellt (Abb. 2e).Darüber hinaus ist CCY141 zusammen mit CCR140 aus demselben und CCE39 aus dem benachbarten Protomer an einer Wasserstoffbindungstriade beteiligt (Abb. 2e).Wie bereits berichtet22, ist die lange Linkerregion zwischen der Coiled-Coil- und der NBD-Domäne auch an der Vermittlung der Oligomerisierung des Sr35-Resistosoms beteiligt.Um die Anforderungen für diese Wechselwirkungen bei der Vermittlung des Zusammenbaus des heterooligomeren Sr35-Komplexes funktionell zu testen, führten wir Aminosäuresubstitutionen in den Rezeptor ein und bewerteten ihren Einfluss auf den Sr35-vermittelten Zelltod mit einem Luciferase (LUC)-Aktivitätsassay in Weizenprotoplasten23 von einem Genotyp, der AvrSr35 nicht erkennt (Sorte 'Chinese Spring').In diesem Protoplasten-Transfektionsassay ist die relative (zu leerem Vektor, EV) Lumineszenz des LUC-Reporters ein Indikator für die Zelllebensfähigkeit.Die Kotransfektion von Sr35, AvrSr35 und dem LUC-Reporter führte zu einem nahezu vollständigen Verlust des Lumineszenzsignals, was auf massiven Zelltod der Protoplasten hinweist und auf eine Rezeptoraktivierung durch AvrSr35 hindeutet (Fig. 2g).In Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Insektenzelldaten zeigten Weizenprotoplasten, die Sr35L15E/L19E und AvrSr35 coexprimieren, Lumineszenzniveaus, die mit denen vergleichbar waren, die EV- und AvrSr35-Konstrukte coexprimieren, was darauf hinweist, dass die Zelltodaktivität des Sr35L15E/L19E-Rezeptors wesentlich beeinträchtigt ist (Abb. 2g).Ein ähnlich drastischer Verlust der rezeptorvermittelten Zelltodaktivität wurde bei Substitutionen beobachtet, von denen vorhergesagt wurde, dass sie Coiled-Coil-Interprotomer-Wechselwirkungen (Y141A, L42E und L42E/Y141A) oder die ATP-Bindungsstelle (R311A) beeinflussen (Abb. 2g) (Rohdaten von alle Protoplastenmessungen sind in der Ergänzungstabelle 2 angegeben).Um die Daten aus Weizenprotoplasten zu bestätigen, verwendeten wir die Agrobacterium tumefaciens-vermittelte transiente Genexpression von Sr35 und AvrSr35 in N. benthamiana-Blättern.Die Co-Expression von Sr35 und AvrSr35, aber nicht AvrSr35 plus EV, führte zum Zelltod im Agrobacterium-infiltrierten Bereich (Abb. 2h).Im Gegensatz dazu wurde der Zelltod aufgehoben, wenn AvrSr35 mit den Sr35-Mutanten koexprimiert wurde, von denen vorhergesagt wurde, dass sie die Sr35-Oligomerisierung stören ( 2h ), mit Ausnahme von Sr35L42E, das nur in N. benthamiana (Vollversionen von allen Tabak-Agroinfiltrationen sind in den ergänzenden Abb. 1–8 enthalten).In Planta waren die Proteinspiegel von Wildtyp-Sr35 und allen getesteten Rezeptormutanten vergleichbar, was darauf hinweist, dass diese Substitutionen den Rezeptor nicht instabil machen (Erweiterte Daten, Abb. 3a, und vollständige Versionen aller Blots sind in den ergänzenden Abb. 9–11 enthalten ).Zusammengenommen legen diese Daten stark nahe, dass die Reste, die die Sr35-Oligomerisierung in der Kryo-EM-Struktur vermitteln, für die Zelltodaktivität in Weizen und heterologem N. benthamiana notwendig sind.Es wird eine konservierte Sequenz in der Coiled-Coil-Domäne verwendet, die seit langem als „EDVID (Glu-Asp-Val-Ile-Asp)-Motiv“ bekannt ist und in etwa 38 % der CNLs von Arabidopsis24 vorkommt und erstmals im CNL Rx der Kartoffel beschrieben wurde um CNLs mit oder ohne dieses Motiv zu gruppieren24,25.In der Kryo-EM-Struktur des Sr35-Resistosoms vermitteln das EDIVD-Motiv (Glu-Asp-Ile-Val-Asp) und das benachbarte Sr35 Y74 die Packung der LRR-Domäne gegen die Coiled-Coil-Domäne.Saure Reste aus dem Motiv bilden starke Kontakte mit fünf Argininresten in der LRR-Domäne (LRRR537, LRRR538, LRRR557, LRRR580 und LRRR602).Diese Kontakte umfassen zwei zweizähnige Salzbindungen und eine Kation-π-Wechselwirkung (Abb. 2b,f).Die ausgedehnten Kontakte in dieser Region werden durch Wasserstoffbrückenbindungen und Van-der-Waals-Kontakte weiter verstärkt.Diese Argininreste sind jeweils durch eine Iteration des LRR-Motivs getrennt, was zu ihrer räumlichen Trennung entlang der Sr35-Aminosäuresequenz führt (erweiterte Daten, Fig. 4a).Wie bereits erwähnt26, zeigt die Kryo-EM-Struktur des ZAR1-Resistosoms, dass ähnliche intramolekulare Wechselwirkungen zwischen Argininresten im ZAR1-LRR und „EDVID“ bestehen.In beiden Resistosomen lagern sich die jeweiligen Argininreste zusammen und bilden einen positiv geladenen Oberflächenfleck (erweiterte Daten, Abb. 4b).Wir bezeichnen daher diese Resistosomenregion als LRRR-Cluster.Die Lage der Argininreste in verschiedenen Wiederholungen der LRR-Domäne erklärt, warum die Konservierung des LRRR-Clusters unbemerkt geblieben war.Ein Sequenz-Alignment von CNLs zeigt, dass der LRRR-Cluster konserviert ist und zusammen mit dem EDVID-Motiv auftritt (erweiterte Daten, Fig. 4a).Um zu testen, ob der LRRR-Cluster für den Sr35-vermittelten Zelltod notwendig ist, ersetzten wir Reste von der Schnittstelle zwischen dem Arginin-Cluster und dem EDIVD-Motiv und bewerteten den Einfluss dieser Mutationen auf die Zelltodaktivität unter Verwendung des Weizenprotoplasten und des N. benthamiana-Blatts oben beschriebenen Assays.Gleichzeitige Mutationen von LRRR537A/R538A im LRRR-Cluster beseitigten im Wesentlichen die Zelltodaktivität (Abb. 2i, j).In ähnlicher Weise verringerte oder beseitigte eine dreifache Substitution im Sr35-EDIVD-Motiv, einschließlich des benachbarten Sr35-Y74 (Y74A/E77A/D78A), die Sr35-Zelltodaktivität in Protoplasten und N. benthamiana, ohne die NLR-Stabilität zu beeinträchtigen (erweiterte Daten, Fig. 3b).Diese Beobachtungen legen nahe, dass das gemeinsame Vorkommen des EDVID-Motivs und des LRRR-Clusters ein evolutionär konservierter Stabilisierungsmechanismus von CNL-Resistosomen ist.Da die EDVID-LRRR-Cluster-Wechselwirkungen auch in den inaktiven ZAR1- und AlphaFold2-modellierten Sr35-Monomeren vorhanden sind und während der Rezeptoraktivierung ein umfangreiches Umschalten der Faltung in der Coiled-Coil-Domäne auftritt (erweiterte Daten, Abb. 4c), können diese intramolekularen Wechselwirkungen vorübergehend sein unterbrochen, damit die α1-Helix kippen kann.Obwohl die Sequenzkonservierung nur 28,4 % beträgt und die α1-Helix-Region von Sr35, dessen Äquivalent im ZAR1-Resistosom eine trichterförmige Struktur bildet, nicht gut definiert ist, sind die Strukturen der Weizen-Sr35- und Arabidopsis-ZAR1-Resistosomen sehr ähnlich (Extended Data Abb. 5).Wir schlussfolgerten daher, dass die beiden Komplexe die Kanalaktivität teilen könnten.Um diese Vermutung zu testen, verwendeten wir einen Assay, der zuvor in Oozyten von Xenopus laevis (Xenopus)4 etabliert wurde, um die potenzielle Kanalaktivität des Sr35-Resistosoms zu bewerten.Die Co-Expression von Sr35 und AvrSr35, aber nicht von beiden allein, erzeugte Ströme, wie sie mit einer Zwei-Elektroden-Spannungsklemme aufgezeichnet wurden (Abb. 3a, b), was darauf hindeutet, dass der Zusammenbau des Sr35-Resistosoms für die Ströme erforderlich ist.In starker Unterstützung dieser Schlussfolgerung verloren zwei Sr35-Mutanten, die die Interaktion mit AvrSr35 beeinträchtigten und die AvrSr35-abhängige Zelltodaktivität des Rezeptors in Planta aufhoben (Sr35R730D/R755Q und Sr35W803L/K754G; siehe unten), ihre Fähigkeit, Ströme in Oozyten zu erzeugen (Abb. 3c).In Übereinstimmung mit den Daten zum Zelltod in Pflanzen- und Insektenzellen vermittelte die Koexpression der α1-Helix-Substitutionsmutante Sr35L15E/L19E mit AvrSr35 keine Ströme in Oozyten (Fig. 3c).Es wurde gezeigt, dass Substitutionen, die die saure Innenauskleidung des durch α1-Helices in ZAR1E11A gebildeten Trichters beeinflussen, den Zelltod in Planta aufheben und Aktivitäten in Oozyten kanalisieren3,4.Unerwarteterweise waren sowohl der Sr35-Resistosomenkanal als auch die Zelltodaktivitäten tolerant gegenüber diesen analogen Säurerestsubstitutionen (Sr35E17A/E22A) (Abb. 3c–e und erweiterte Daten Abb. 3c) (Rohdaten aller Oozytenmessungen sind in der Ergänzungstabelle 4 enthalten). .a, Repräsentative Messungen von Zwei-Elektroden-Aufzeichnungen (TEVC) von Xenopus-Oozyten, die Sr35, AvrSr35 und Sr35/AvrSr35 exprimieren.Wirkungen von CaCCinh-A01 (Ca2+-aktivierter Chloridkanal-Inhibitor) und LaCl3 (Ca2+-Kanalblocker) auf die Sr35-vermittelten Ströme in ND96-Lösung (96 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH-Wert 7,6).Stromkurven bei verschiedenen Spannungen von –110 mV bis +70 mV in 20-mV-Schritten und Stromamplituden bei –110 mV.b, Quantitative Messungen von Daten wie in a.c, Strukturbasierte Mutagenese von Sr35-Resten an der Schnittstelle zwischen der LRR-Domäne von Sr35 und AvrSr35 und Sr35-α1-Helix.TEVC-Aufzeichnungen in ND96-Lösung und Stromamplituden bei –110 mV.d, Weizenprotoplastendaten von Sr35-Mutationen an der α1-Helix.Relative Lumineszenz als Anzeige für Zelltod.Die EV-Behandlung definierte den relativen Ausgangswert (Mittelwert ± Standardabweichung; n = 5).Teststatistiken abgeleitet von ANOVA- und Tukey-Post-Hoc-Tests (P < 0,05).Genaue P-Werte sind in der Ergänzungstabelle 3 angegeben. e, Tobacco cell death data of Sr35 and Sr35 channel mutants.Repräsentative Daten von mindestens drei Wiederholungen.f, Der Sr35-Kanal ist selektiv für Kationen.TEVC-Aufzeichnungen wurden in verschiedenen Lösungen durchgeführt, darunter KCl (96 mM), K-Gluconat (96 mM), NaCl (96 mM), Na-Gluconat (96 mM) und TBA-Cl (96 mM).g, kationische Ströme von CaCl2, Ca-Glu, MgCl2 und Mg-Glu in Gegenwart von CaCCinh-A01 und CaCCinh-A01+LaCl3.Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung, n ≥ 8 (b, c, f, g).*P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001, einfache ANOVA-Analysen und Tukey-Post-Hoc-Test in b, c und g und zweiseitiger Student-t- Prüfungen in f.Xenopus-Oozyten exprimieren endogene Calcium-gesteuerte Chloridkanäle (CaCC);daher könnten die in diesem Assay nachgewiesenen Ströme durch die Aktivität dieser nativen Kanäle verfälscht werden.Die Zugabe des CaCC-Inhibitors A01 blockierte jedoch nur teilweise die Ströme in Xenopus-Oozyten (Abb. 3b), und für eine vollständige Hemmung der elektrischen Aktivität war eine Co-Behandlung mit A01 und dem Calciumkanalblocker LaCl3 erforderlich (Abb. 3b).Zusammen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass das Sr35-Resistosom zu gemischten Strömen in Xenopus-Oozyten beitragen kann, möglicherweise über die Calciumkanalaktivität des Sr35-Resistosoms.Um zu testen, ob das Sr35-Resistosom als nichtselektiver Kationenkanal fungieren kann, haben wir den Kationenfluss in Gegenwart von einwertigen Lösungen von Kalium- und Natriumchloridsalzen (KCl, NaCl) getestet.Ähnlich wie beim ZAR1-Resistosom erhöhte die Co-Expression von Sr35 und AvrSr35 den Kationenfluss in Oozyten, der für Kalium- und Natriumsalze mit dem immobilen Gluconat-Gegenion (K-Glu, Na-Glu) beibehalten wurde.Im Gegensatz dazu beobachteten wir nur einen Restionenfluss, wenn ein Chloridsalz des immobilen Tetrabutylammoniums verwendet wurde (TBA-Cl) (Abb. 3f).Ein Vergleich der zweiwertigen Ionen Ca2+ und Mg2+ (MgCl2, CaCl2) in Kombination mit der Co-Expression von Sr35 und AvrSr35 in Oozyten zeigte, dass der Ionenfluss für Calcium signifikant war, aber nicht für Magnesium (Abb. 3g).Dieser Befund unterstützt die Schlussfolgerung, dass das Sr35-Resistosom für Calcium durchlässig ist.Obwohl unsere gesammelten Daten stark darauf hindeuten, dass das Sr35-Resistosom ähnlich wie das ZAR1-Resistosom funktioniert, indem es einen nicht selektiven Calciumkanal bildet, ist die Kanalaktivität des Sr35-Resistosoms tolerant gegenüber Substitutionen von Säureresten, von denen vorhergesagt wird, dass sie die innere Oberfläche des Kanals auskleiden.Daher können wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass sich der N-Terminus des Sr35-Resistosoms (Reste 1–21) strukturell und funktionell von dem des ZAR1-Resistosoms unterscheidet.In der Kryo-EM-Struktur bindet AvrSr35 an den äußerst C-terminalen Teil der Sr35-LRR-Domäne, was einen direkten Erkennungsmechanismus von AvrSr35 durch Sr35 unterstützt (Abb. 4a).AvrSr35 ist viel größer als viele andere Pathogen-Effektoren, aber nur ein kleiner Teil des Proteins steht durch Ladungs- und Formkomplementarität in Kontakt mit dem Sr35-LRR (Abb. 4a und erweiterte Daten Abb. 6a, b).Nahezu alle Reste, die zur Erkennung von AvrSr35 beitragen, stammen von der aufsteigenden lateralen Seite der letzten acht LRRs, und viele der Reste interagieren mit einer einzelnen Helix (&agr;10) von AvrSr35.AvrSr35Y383, AvrSr35A384, AvrSr35Y387 und AvrSr35A388 von einer α10-Seite befinden sich im Zentrum der Sr35-AvrSr35-Grenzfläche und stellen ausgedehnte Kontakte mit ihren jeweiligen benachbarten Resten in Sr35 her (Abb. 4b).Mehrere Reste in der Loop-Region, die sich C-terminal zu α10 befinden, bilden hydrophobe Kontakte mit Sr35W919.Ähnliche Wechselwirkungen finden auch zwischen AvrSr35R381 auf der N-terminalen Seite von α10 und Sr35 statt.Zusätzlich zu den hydrophoben und Van-der-Waals-Wechselwirkungen vermittelt auch ein großes Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen die Sr35-AvrSr35-Grenzfläche, was die spezifische Erkennung von AvrSr35 durch Sr35 unterstützt (einzelne Kontakte in Abb. 4b).a, Schnittstelle zwischen Sr35 LRR und AvrSr35.Die rote Farbe zeigt die kritischen LRR-Reste innerhalb von 5 Å von AvrSr35 an.b, Strukturdetails von Sr35-Rezeptor und AvrSr35-Effektor-Schnittstelle.Gestrichelte Linien repräsentieren polare Wechselwirkungen.Graue und weiße Kästchen mit Restetiketten entsprechen Sr35- bzw. AvrSr35-Seitenketten.c, Cotransfektion von Sr35-LRR-Mutanten mit AvrS35 in Weizenprotoplasten.Relative Lumineszenz als Anzeige für Zelltod.Die EV-Behandlung definierte den relativen Ausgangswert (Mittelwert ± Standardabweichung; n = 5).Teststatistiken abgeleitet von ANOVA- und Tukey-Post-Hoc-Tests (P < 0,05).Genaue P-Werte für alle Protoplastenplots sind in der Ergänzungstabelle 3 angegeben. Die Balkenfarben entsprechen den Kästchenfarben in b.d, Nicotiana benthamiana-Zelltoddaten von Sr35-LRR-Mutationen an der Rezeptor-Effektor-Grenzfläche.Repräsentative Daten von 11 Wiederholungen werden gezeigt und auf Blattzelltod bewertet.e, Cotransfektion von Sr35 mit AvrS35-Mutanten in Weizenprotoplasten.Versuchsaufbau und Statistik wie in c (Mittelwert ± SEM; n = 5).Balkenfarben als Domänenfarben in a.f, Zelltoddaten von Nicotiana benthamiana von AvrSr35-Mutanten, die mit Sr35 coexprimiert wurden.Repräsentative Daten von neun Wiederholungen werden gezeigt und auf Blattzelltod bewertet.Um die Sr35-AvrSr35-Wechselwirkung funktionell zu verifizieren, ersetzten wir zunächst R730, R755 und W803 in Sr35 durch ihre Gegenstücke im Sr35-Homologen der Weizensorte Chinese Spring27 (hier als TaSh1 bezeichnet), das 86,5 % Sequenzidentität mit Sr35 teilt, aber von a abgeleitet ist Weizensorte, die für Pgt-Stämme, die AvrSr3514 codieren, anfällig ist.Diese W803L- oder R730D-Substitutionen unterdrückten die Sr35-vermittelte Zelltodaktivität stark bzw. schwach, wenn sie mit AvrSr35 in Weizenprotoplasten coexprimiert wurden ( 4c ).Im Gegensatz dazu hatte R755Q keine nachweisbare Wirkung auf den Sr35-induzierten Zelltod, aber seine Kombination mit R730D führte zu einem vollständigen Verlust des Zelltods in Weizenprotoplasten ( 4c ).Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, als diese Sr35-Mutanten in N. benthamiana getestet wurden (Fig. 4d und Erweiterte Daten Fig. 3d).Diese Daten unterstützen die Sr35-AvrSr35-Wechselwirkung in der Kryo-EM-Struktur und erklären, warum TaSh1 in der anfälligen Sorte Chinese Spring AvrSr35 nicht erkennen kann.Um die spezifische AvrSr35-Erkennung durch Sr35 weiter zu verifizieren, haben wir die folgenden Substitutionen im Pilzeffektor an ihrer Schnittstelle vorgenommen: Y383A, Y387A, R395A, Y387A/R395A, Y387A/R381A, A384Y/A388Y, die alle entweder Wasserstoffbrückenbindungen oder Salz bilden. Brücken mit dem Sr35 LRR (Abb. 4b).Ähnlich wie bei der Q72*-Mutante des vorzeitigen Stoppcodons von AvrSr35 (Abb. 4e)6 verhinderten die Mutationen Y387A/R395A, Y387A/R381A und A384Y/A388Y den Sr35-induzierten Zelltod in Weizenprotoplasten und N. benthamiana (Abb. 4e,f und erweiterte Daten Fig. 3e).Im Gegensatz dazu hoben einzelne Mutationen von Y387A und R395A die durch Effektoren ausgelöste Rezeptoraktivierung nur teilweise auf (Abb. 4e, f und erweiterte Daten, Abb. 3e), und mehrere andere einzelne Mutationen von AvrSr35 (erweiterte Daten, Abb. 6b) hatten keine Wirkung, was darauf hindeutet dass ein großer Teil der AvrSr35-Sr35-Grenzfläche widerstandsfähig gegenüber Störungen durch einzelne Aminosäuresubstitutionen ist.Wir machten strukturelle Vorhersagen von inaktivem, monomerem Sr35 unter Verwendung von AlphaFold2 (Lit. 28).Bei diesen Vorhersagen waren die Strukturen aller einzelnen Domänen denen im Sr35-Resistosom sehr ähnlich, und insbesondere die LRR-Domäne wurde genau vorhergesagt (Erweiterte Daten, Abb. 7a).Obwohl einige Vorhersagen eng mit der Domänenorganisation von Sr35 im Resistosom übereinstimmten, zeigten andere individuelle Vorhersagen bemerkenswerte Unterschiede in der Domänenorganisation des NOD-Moduls (NBD-HD1 relativ zu WHD) (Erweiterte Daten, Abb. 7b).Diese Vorhersagen teilten die relative Domänenorganisation von inaktivem, monomerem ZAR1 und anderen inaktiven NLR-Strukturen29 und repräsentieren höchstwahrscheinlich eine inaktive Sr35-Struktur.Die Modellierung von AvrSr35 auf die LRR-Domäne der vorhergesagten Struktur von inaktivem Sr35 zeigt eine erhebliche Überlappung zwischen dem Effektor und Sr35 NBD (erweiterte Daten, Fig. 8).Dies erinnert an die ZAR1-Aktivierung, die durch einen allosterischen Mechanismus auftritt, der einen „sterischen Zusammenstoß“ mit dem NBD2,3 beinhaltet.Ein Vergleich von Sr35- und ZAR1-Resistosomen legt nahe, dass dieser Mechanismus des „sterischen Zusammenstoßes“ wahrscheinlich in CNLs konserviert ist.Die AvrSr35-Bindung verdrängt die NBD, was einen anschließenden Nukleotidaustausch für weitere ATP-ausgelöste allosterische Veränderungen im Rezeptor und den Zusammenbau des Sr35-Resistosoms ermöglicht.Zusammen unterstützen diese Ergebnisse einen konservierten allosterischen Mechanismus, der der Aktivierung der Sr35- und ZAR1-Resistosomen zugrunde liegt.Die Ligandenbindung an die aufsteigende laterale Seite der LRR-Domäne wurde auch in den Strukturen der TNL RPP1 (Ref. 30) und Roq1 (Ref. 31) Resistosomen (erweiterte Daten, Fig. 9) gesehen, was darauf hindeutet, dass der Ligandenbindungsmechanismus sein könnte konserviert in Pflanzen-NLRs29.Um zu testen, ob die evolutionäre Konservierung von CNL-Resistosomen für das Design neuer Rezeptoren mit veränderter Funktion genutzt werden kann, haben wir zunächst zwei eng verwandte Sr35-Homologe (Sh) mit unbekannter Resistenzfunktion in Brotweizen (Triticumaestivum; TaSh1) und in der Schwesterart ausgewählt Gerste (Hordeumvulgare; HvSh1).Wir erzeugten Hybridrezeptoren von TaSh1 und HvSh1, in denen die LRR-Domäne, einschließlich der hochkonservierten WHD-α4-Helix, durch das äquivalente Fragment von Sr35 (als TaSh1Sr35LRR und HvShSr35LRR bezeichnet) ersetzt wurde (Abb. 5a und Erweiterte Daten Abb. 10a).Im Gegensatz zu Wildtyp-TaSh1- oder HvSh1-Genen vermittelten beide Hybridrezeptoren den AvrSr35-abhängigen Zelltod in Weizenblatt-Protoplasten, die aus der Sorte Chinese Spring hergestellt und in Blättern von N. benthamiana exprimiert wurden (Abb. 5b – d), was auf eine Neofunktionalisierung der Orphan-Rezeptoren hinweist .a, Illustration der Sr35-Domänenstruktur und Hybridrezeptoren, hergestellt aus Sr35-Homologen (Sh) in Brotweizen (Triticum aestivum; TaSh1) und Gerste (Hordeum vulgare; HvSh1).Sr35LRR (rot) ersetzt TaSH1LRR und HvSH1LRR (TaSH1Sr35LRR und HvSH1Sr35LRR).GOF-Rezeptorvarianten (TaSh1GOF und HvSh1GOF) wurden von Sequenzpolymorphismen zwischen Sr35, TaSH1 und HvSH1 abgeleitet.b, Weizenprotoplastentransfektionen von TaSh1Sr35LRR, HvSh1Sr35LRR und Kontrollen, die mit AvrSr35 coexprimiert werden.Die EV-Behandlung definierte den relativen Ausgangswert (Mittelwert ± Standardabweichung; n = 6).Teststatistiken abgeleitet von ANOVA- und Tukey-Post-Hoc-Tests (P < 0,05).Genaue P-Werte für alle Protoplastenplots sind in der Ergänzungstabelle 3 angegeben. c, Tabakzelltod von TaSh1Sr35LRR und HvSh1Sr35LRR.Repräsentative Daten von sieben Wiederholungen gezeigt und auf Zelltod bewertet.d, Western Blot von in Tabak getesteten Hybridrezeptoren.Gepoolte drei Wiederholungen.Ponceau-S-Färbung als Ladekontrolle.Zusammengesetztes Bild desselben Flecks.e, Cryo-EM-Struktur von Sr35 und strukturelle Vorhersagen von TaSH1LRR und HvSH1LRR (Lit. 28).Polymorphismen zwischen TaSH1 oder HvSH1 und Sr35 sind dargestellt (orange).Mutierte Reste sind rot dargestellt.f, Weizenprotoplasten-Transfektionen von TaSh1GOF, HvSh1GOF und Kontrollen, co-exprimiert mit AvrSr35.Experiment und Statistik wie in b.g, Tabakzelltod von TaSh1GOF und HvSh1GOF.Wiederholungen und Bewertung wie in c.h, Western Blot des GOF-Experiments in Tabak.Replikationen und Ladekontrolle wie in d.i, grafische Darstellung von MLA-Hybridrezeptoren;Ausführung wie in a (HvMla10Sr35LRR und HvMla13Sr35LRR).j, Weizenprotoplastentransfektionen von HvMla10Sr35LRR, HvMla13Sr35LRR und Kontrollen, die mit AvrSr35 coexprimiert werden.Experiment und Statistik wie in b.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarNat.Artikel CAS PubMedGoogle ScholarProz.Natl. 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